Объектив собирает веер лучей от каждой точки объекта и изображает пучок лучей в передней фокальной плоскости окуляра. К формированию изображения применяются обычные правила трассировки лучей. В отсутствие аберраций геометрические лучи формируют точечное изображение каждой точки объекта. При наличии аберраций каждая точка объекта представлена нечеткой точкой. Окуляр предназначен для изображения лучей в фокальной точке, расположенной на удобном для просмотра расстоянии. В этой системе яркость изображения определяется размерами апертур объективов и апертурой зрачка глаза. Фокусное расстояние и результирующее увеличение объектива должны быть подобраны таким образом, чтобы достичь желаемого разрешения объекта при размере, удобном для просмотра через окуляр. Формирование изображения в микроскопе осложняется дифракцией и интерференцией, происходящими в системе формирования изображения, а также необходимостью использовать источник света, который формирует изображение в фокальной плоскости.
Современная теория формирования изображения в микроскопе была основана в 1873 году немецким физиком Эрнстом Аббе. Отправной точкой теории Аббе является то, что объекты в фокальной плоскости микроскопа освещаются сходящимся светом от конденсора. Сходящийся свет от источника можно рассматривать как совокупность множества плоских волн, распространяющихся в определенном наборе направлений и накладывающихся друг на друга, образуя падающее освещение. Каждая из этих эффективных плоских волн дифрагирует на деталях в плоскости объекта: чем меньше детальная структура объекта, тем больше угол дифракции.
Структура объекта может быть представлена в виде суммы синусоидальных составляющих. Скорость изменения компонентов в пространстве определяется периодом каждого компонента, или расстоянием между соседними пиками синусоидальной функции. Пространственная частота равна обратной величине периода. Чем мельче детали, тем выше требуемая пространственная частота компонентов, представляющих детали объекта. Каждый компонент пространственной частоты создает дифракцию под определенным углом, зависящим от длины волны света. Например, компоненты пространственной частоты с периодом 1 мкм будут иметь пространственную частоту 1 000 линий на миллиметр. Угол дифракции такого компонента для видимого света с длиной волны 550 нанометров (нм; 1 нанометр равен 10-9 метра) составит 33,6°. Объектив микроскопа собирает эти дифрагированные волны и направляет их на плоскость изображения, где интерференция между дифрагированными волнами создает изображение объекта.
Поскольку апертура объектива ограничена, не все дифрагированные волны от объекта могут быть пропущены объективом. Аббе показал, что чем большее количество дифрагированных волн достигает объектива, тем более мелкие детали можно восстановить на изображении. Он назвал числовую апертуру (N.A.) мерой способности объектива собирать дифрагированный свет и, таким образом, его способности разрешать детали. Исходя из этого, очевидно, что чем больше увеличение объектива, тем больше должна быть его числовая апертура. Наибольшее теоретически возможное значение N.A. в воздухе составляет 1,0, но ограничения оптической конструкции ограничивают достижимое значение N.A. примерно 0,95 для сухих объективов.
Для приведенного выше примера с образцом с пространственной частотой 1 000 линий на миллиметр, требуемое значение N.A. для сбора дифрагированного света составит 0,55. Таким образом, для наблюдения и сбора полезных данных об объекте с деталями, расположенными на расстоянии 1 мкм друг от друга, необходимо использовать объектив со светосилой 0,55 Н.А. или выше. Если объектив имеет меньшую ЧСС, детали объекта не будут разрешены. Попытки увеличить детали изображения с помощью мощного окуляра не приведут к увеличению разрешения. Это последнее состояние называется пустым увеличением.
Длина волны света сокращается, когда он распространяется через плотную среду. Для разрешения мельчайших деталей иммерсионные объективы способны собирать свет, дифрагированный более мелкими деталями, чем объективы на воздухе. Н.А. умножается на показатель преломления среды, и рабочие Н.А. могут составлять 1,4. В лучших оптических микроскопах можно наблюдать структуры с пространственной частотой до 0,4 мкм. Отметим, что одиночные линзы, изготовленные Левенгуком, как было показано, способны разрешать фибриллы толщиной всего 0,7 мкм.
